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利用WIWAM叶绿素荧光成像模块进行生物胁迫研究

Kautsky和Hirsch 在1931年报道了经PAR暗适应照明的植物的红叶绿素a荧光(Chl-F）发射的变化。该Chl-F 显示了与光合效率的高相关性。自此，科研人员对该技术进行了深入探索以监控植物的光合性能与胁迫。如不使用Chl-F 数据，任何关于光合活力的调查都是不完善的。另外，Chl-F 对植物代谢较小变化敏感性使其非常适于对植物与逆境胁迫因子互作进行研究。Chl-F 成像的设备的发展使其成为一种在胁迫条件下区分植物和叶片光合性能的高分辨率利器。叶绿素荧光成像(Chl-FI) 提供了大量病原体演化的时间和位置信息，并协助理解叶片到整个植株的水平的光合作用调控。Chl-FI研究包括在各种组学如植物表型组学、代谢组学、基因组学以及蛋白组学之中。随着集成技术的进步，Chl-FI 叶绿素荧光成像模块也可以集成在高通量植物表型成像平台中，其中整合水准较高的是WIWAM植物表型成像平台。

生物胁迫检测中常用Chl-F参数

叶绿素荧光成像模块广泛用于：(i)光合设备对不同生物胁迫因子的反应-病原体(病毒、细菌、真菌)以及害虫(食草类，寄生虫）—利用Chl-FI分析在实验室层次(ii)基于Chl-F和替代物的研发方案，用于研究田间光合性能，用于鉴别生物胁迫。

高通量植物表型分析技术通过整合传感器、自动控制、环境调控以及数据挖掘等多种先进技术，有效地解决传统植物表型分析技术中存在的费时费力、精度低、适用性弱等问题，为阐明不同环境因子及基因型对植物生长、产量、质量、生理状态的影响及研究植物不同表型间的关系提供了有效的帮助。其中，光学技术以其非接触性、快速、无损伤、高灵敏度、高分辨率等优势为高通量植物表型分析提供了技术支撑。光学成像技术主要包括RGB成像、多光谱/高光谱成像、叶绿素荧光成像和热红外成像等，这些技术在获取植物的叶/冠层形态生长模型、逆境响应、养分生理、光合作用、冠层温度等信息上具有很大的优势。其中，叶绿素荧光技术可以通过对叶绿素荧光的探测分析PSII内的生理反应过程，如光化学反应、热散失等，能反映实际生物学意义，该技术已应用于植物的逆境生理检测、病虫害检测、光合作用机理及抗逆性生理等研究。此外，结合图像技术，可以较好地反映植物在叶片和冠层水平的光合 生理的空间异质性。叶绿素荧光图像信息量丰富，利用数据挖掘、机器学习等方法可进一步挖掘图像的潜在信息。由于叶绿素荧光技术的多种优势，在高通量植物表型分析中的应用也越来越广。

叶绿素荧光成像系统克服了传统荧光仪有限点测量的缺点而被逐渐广泛应用。系统一般包括激发光源、滤波片、检 测器、计算机和控制模块等，可以获得植物叶片或冠层的叶绿素荧光信号，结合数字图像处理技术可分析荧光强度在空间的分布情况。不同的测量方案可以获得不同的荧光诱导猝灭曲线，其中光源和光照模式的设置是方案选择的关键。光源的主要类型有测量光、光化光与饱和光。测量光用于激发暗适应后较小荧光，通常选择蓝光或红光；光化光是一种近似自然光的光源，光化光的光强与自然光十分相近，研究人员通常选择蓝光或红光使植物的光合系统产生实质上的光化学反应；饱和光的光强度较过植物光合系统的捕光能力，使叶绿素荧光强度达到较高，通常选择白光。不同光照模式可以获取不同的光合作用信息。

WIWAM为比利时根特大学构建了一款高通量叶绿素荧光表型成像系统，系统可自动在百万分之一秒速度测量荧光图片，提供光合系统II的Kautsky诱导曲线的0-, J-, I以及P。每个像素的荧光参数可计算出来，以图像显示。相同光学设置外加滤波轮可用于拍摄多光谱图像，用于荧光成像。设备可生成Chl-index 指数图像(与叶绿素量相关)，Ant-index 指数(与花青素含量相关), NDVI，NIR以及颜色，系统可高通量测量整个植株的荧光以及光谱图。系统基于sensor-to-plant理念设计，多功能平台还专门进行定制设计，可容纳高达20cm的小植株以及多孔板。系统还可对GFP以及RFP成像。系统还配置了WIWAM自主开发的高精度称重和浇水系统。

相机参数正如综述所描述，相机帧速达100帧/秒（14bit，相机曝光时间5μs），配置All LED light sources for红、远红、白、NIRLED光源，内置计算机，荧光和多光谱逐像素信息

拍摄图像：100 荧光图像/秒，黑暗: F0, FJ, FI, FM，光下t: Ft’, FJ’,FI’以及FM’，6波段光谱图，成像面积20×20 cm2，大景深(DOF)。

植物多个参数

Fv/FM=φPo=(FM-F0)/FM(较大量子产率，PSII 光合系统photochemistry)

φEo=(FM-FJ)/FM (电子传输量子产量)

φRo=(FM-FI)/FM(PSI终端受体量子产量降低)

tFM( FM时间)

A (诱导曲线上方面积)以及Sm (FM-F0归一面积)

PIabs(性能指标)

φPSII=φPt=Fq’/FM’=(FM’-Ft’)/FM’(PSII 光合系统有效光子产量)

ETR (电子传递速率)

NPQ, F0’,qN,qP以及Rfd

Chl-index, Ant-index, NIR, NDVI, 红、绿、蓝色

开源软件或其他软件16 bit拍摄原图 

根特大学利用高通量表型平台研究方向

在LAMP，还进行表型组学以及基因编辑技术的组合研究，研究者可进行植物病害修饰或标记和有益菌研究，帮助我们以前所未有的分辨率揭示植物与微生物互作。基于同源重组技术和较先进基于Crispr技术的转化平台可在几种真菌上进行，如镰刀菌、曲霉以及枯菌。

(iii)生物分析和生物报告植物

PathoViewer还可高通量进扫描新型生物活性分子或具有除草剂或生物刺激素作用的新农业化学品。使用生物报告有机物如啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，带人雌激素受体，浮萍Lemna minor以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）

叶绿素荧光成像模块其它应用

基于WIWAM XY植物表型成像系统的文章发表在先进期刊如Nature Biotechnology等上面，是迄今为止，发表文章级别较高的高通量植物表型成像系统之一。

北京欧亚国际科技有限公司是WIWAM植物植物表型成像系统中国区总代理，全面负责其系列产品在中国市场的推广、销售和售后服务。